[Principal] [Qui sóc?] [Fotos i còmics] [Pàgines favorites]  

[Apunts de Medicina] [Fórum d'idees]

BIOLOGIA MOLECULAR:

BIOLOGIA MOLECULAR:

Estructura primaria dels àcids nuclèics:

Els àcids nuclèics són macromolècules minoritàries. Sòn molècules grans amb estructura tridimensional. Formen el 1,5% del pes corporal, front al 15% representat per les proteïnes (per exemple).

Hi ha distints tipus: DNA (àcid desoxirribonuclèic) i RNA (àcid ribonuclèic). Entre els dos presenten diferències químiques, diferències estructurals i diferències funcionals. En el mateix ordre, hi ha de menor a major diferència.

Composició química.

Els àcids nuclèics estan formats per la polimerització d’unitats fundamentals: són els nucleòtids.

Un nucleòtid està format per una base nitrogenada, un àcid fosfòric i un sucre. En condicions fisiològiques, l’àcid fosfòric està totalment disociat.

Les bases.

Hi ha dos tipus de bases nitrogenades: les púriques i les pirimidíniques. Les bases púriques són adenina i guanina, i tenen l’estructura de la purina. Les bases pirimidíniques són la citosina, la timina i l’uracil, i tenen l’estructura de la pirimidina. Es distribueixen de forma distinta en el DNA i el RNA. El DNA té timines mentres que el RNA sempre té uracils.

Els sucres.

El sucre que forma part dels nucleòtids ès una aldopentosa. Hi ha dos tipos, la ribosa i la desoxirribosa. La ribosa forma part del RNA, i condiciona l’estructura d’aquest, degut a que la presència d’un grup alcohol en el carbono 2’ la fa molt més reactiva. Açò pot determinar, per exemple, l’existència de ribozimes (RNA amb característiques enzimàtiques). Per altra banda, el DNA utilitza una desoxirribosa, que ès molt més estable.

Nucleosids:

La unió de la base nitrogenada amb el sucre determina la formació d’un nucleósid. L’enllaç entre ells dos és de tipus beta-N-glucosídic. L’enllaç glucosídic es dona entre el carbono 1’ del sucre i l’hidrògen unit a N9 en púriques i a N1 en pirimidíniques.

Nucleotids.

El nucleótid es forma quan el nucleósid s’unix a l’àcid fosfòric. La unió es produeix a partir d’un enllaç éster.

Estructura primària:

L’àcid nuclèic serà un polinucleòtid. Hi haurà una part constant en tot l’àcid nuclèic, que és l’esquelet de fosfat i sucre, mentres que hi haurà una part variable, que seran les bases. Els dos extrems no seran iguals, ja que tindran polaritat. Un extrem serà el 5’ i l’altre serà el 3’-OH.

Hi ha diverses posibles representacions dels aa nn. Actualment la que s’utilitza és la seqüència de bases nitrogenades.

Podem trobar gran quantitat de bases al RNA, degut a modificacions postranscripcionals. Aquestes modificacions estan encaminades a donar funcionalitat al RNA. Al mRNA és a l’únic a qui no se li modifiquen les bases. En el DNAno deu d’haver modificacions de bases, però si hi ha, seran reparades per enzims reparadors. En el DNA les bases es poden metilar (procés reversible). Açò serveix per a regular la transcripció. Les zones molt metilades s’inactiven.

Altres funcions dels nucleotids.

Els nucleótids poden tenir altres funcions a banda de formar part dels aa nn. Formen part de l’ATP o el GTP. Es combinen amb altres substàncies per a donar lloc a molècules com el coenzimA. Poden donar lloc a enzims redox com el NAD+ i el FAD. Poden donar lloc a l’AMPc, que és un segon missatger de les hormones (GMPc). També podem sintetitzar artificialment nucleòtids amb interés químic, com el AZT (azidotimidina), utilitzat en la terapia contra el sida, ja que inhibeix la transcriptasa reversa. En la quimioteràpia injectem bases nitrogenades artificials per a inhibir els processos metabòlics de les cèl·lules tumorals.

Organització de les seqüències del DNA.

El contingut de DNA varia en cada organisme.

El contingut del DNA varia per a cada organisme. De fet, E.Colli té aproximadament 3000 parells de nucleòtids, quan una cèl·lula humana té 3000 millons de parells de nucleòtids.

Per regla general, quant més contingut de DNA hi haja en un organisme, més complexe serà, però açò no sempre és així. Per eixemple, el tritó o el guisant tenen més DNA que una persona, i no són organismes més complexes.

El que si és veritat, és que els gens eucariotes són molt més complexes que els gens procariotes, ja que tenen més ADN per gen. La organització és molt distinta per a eucariotes i per a procariotes. Per exemple, en E.Colli, tot el genoma són gens. Aquests gens van tots seguidets, e inclús es solapen. Però en eucariotes, tenim gran quantitat de seqüències distintes, i moltes no sabem per a que serveixen.

Tipus de seqüències de DNA.

·        Seqüències úniques: Són el 70%. Hi ha varios tipus:

Codifiquen proteïnes. Estan formades per introns i per exons. Els introns són codis que no formen part de les proteïnes, mentres que els exons són seqüències molt més cortes que els introns que porten la informació genètica per a sintetitzar proteïnes (2% de tota la seqüència única).

Seudogens: Són copies inactives, de les que no es sap la funció.

DNA espaciador: Són seqüències llarguíssimes, de les que no es coneix la funció.

·        Moderadament repetides (20%). Es repetixen de 2 a 100 voltes. Algunes codifiquen per a proteïnes com les histones. Altres codifiquen per a RNA (rRNA i tRNA).

·        Altament repetides (10%). Poden estar repetides de 1000 a 1000000 de voltes. També s’anomena DNA egoista. Hi ha distints tipus:

DNA satèl·lit. Són seqüències molt curtes que es repeteixen i es posen les unes al costat de les altres. Es localitzen en zones concretes dels cromosomes. Es creu que tenen un paper important en el repart del DNA a les cèl·lules filles (centròmers). No es coneix la seua funció.

DNA repetitiu i dispers. Són seqüències molt llargues repetitives i disperses per tots els cromosomes. No està clara la seua funció.

Seqüències ALU: Són seqüències que arriben als 300 nucleòtids. Tenen un punt de tall per a la nucleasa ALU.

Elements genètics mòvils: són seqüències disperses i repetides.

Seqüències palindròmiques: Són seqüències amb un eix de simetria. Si separem les hebres, aquestes podrien encaixar perfectament. Es lligen igual d’un costat a altre. Es creu que poden ser importants en processos de funcionalitat del DNA, com la transcripció, etc.

Definició de gen: Un gen és una seqüència de DNA que reuneix una sèrie de característiques: sempre ha d’existir una regió reguladora en 5’. Poden haver altres reguladors en 3’, és a dir, corrent avall del gen. En els gens estan presents grans introns i exons xicotets. És una unitat complexa per a la síntesi regulada de al menys una molècula de RNA.

Anàlisis de les seqüències del DNA.

Per tal d’analitzar les seqüències, s’ha d’utilitzar diverses tècniques.

·        En primer lloc, hem de tallar la molècula de DNA, ja que degut a la seua gran llargària, no podem analitzar-la tota. Per a aixó utilitzem les nucleases. Hi ha distints tipus de nucleases.

·       Per un costat, tenim les ADNases, que tallen sols cadenes monohebra, i les ARNases, que tallen cadenes en doble hèlix.

·       Les nucleases també poden ser classificades pel lloc per on tallen: si tallen per els extrems, s’anomenaran exonucleases, i si tallen per el mig, s’anomenaran endonucleases. Les exonucleases no podran mai tallar el DNA procariota, degut a que aquest és ciclic i no presenta extrems. Aquests enzims tallen nucleótid per nucleótid. Poden anar en direcció 5’ a 3’ o al revés. Les endonucleases poden tallar DNA eucariota o procariota. Quan tallen un DNA, alliberen grans troços d’aquest, ja que el tallen en troços molt grans. També poden tallar en les dos direccions.

·       Específicament, ens interessa parlar de les endonucleases de restricció. Són endonucleases amb una gran aplicabilitat en el laboratori. Tenen la peculiaritat de tallar el DNA per les seues parts internes, però per seqüències determinades que són capaces de reconèixer. Aquestes seqüències s’anomenen seqüències dianes. Cada endonucleasa de restricció serà específica per a una diana. Aquests enzims són enzims de bactèries (procariotes), per la qual cosa no existeixen en els humans. Generalment reben el nom de de la bactèria d’on es treu i de l’ordre en que s’ha aconseguit per primera volta. Quasi sempre tallaran seqüències palindròmiques. Poden tallar de dues formes: En extrems cohesius, és a dir, que tallen les hebres a distinta altura (la qual cosa serà molt beneficiosa si volem clonar el DNA, ja que quan el fiquem dins de la bactèria, encaixarà en la direcció correcta allà on trobe un tall complementari, i a més conservarem la diana per al mateix enzim). Extrems roms: estan tallats a la mateixa altura, per la qual cosa es poden insertar cara cap a dalt i cara cap a baix.

·        Anàlisis de seqüències determinades. Hi ha dos tècniques per a analitzar dos seqüències determinades:

·       Southern blooting (ADN): Una volta hem fragmentat el DNA per endonucleases de restricció, el sotmetem a una electroforesi per a separar les cadenes en funció del seu tamany. La electroforesi la realitzem sobre gel d’agarosa (poros molt grans). Aleshores haurem separat els fragments més xicotets dels més grans, i ja estem dispostos per a passar el DNA a una membrana de nitrocel·lulosa (pareguda al paper), on aquest s’apega amb facilitat. Per a poder saber quina banda ens interessa, posarem en contacte una sonda carregada radioactivament. La sonda és una seqüència curta complementària a la que busquem, i que porta fòsfor 32 marcat radiactivament. Aleshores, el fragment buscat retindrà la sonda. Però ens farà falta un pas intermitg de desnaturalització del DNA amb àlcali, amb la qual cosa es separen les dues cadenes. Una volta hem afegit la sonda, li fem una autorradiografia, és a dir, cl·loquem una placa fotogràfica damunt de la membrana on està el marcador. Finalment obtindrem la taca del marcador en la placa fotogràfica. Aquesta tècnica s’utilitza per a anàlisis diagnòstics. Si obtinguerem distintes bandes, voldria dir que hi ha distintes seqüències de DNA amb la sonda. Aquesta tècnica és utilitzada a l’hora de buscar patrons de bandes de DNA d’enfermetats congènites.

·       El northern blooting és una tècnica similar utilitzada per al RNA.

 Anàlisis total de la seqüència: seqüenciació.

Hi ha dos mètods, un químic i un altre enzimàtic. El mètode químic és més vell i actualment està en desús.

·        Métode químic: métode de Maxam i Gilbert. Al seqüenciar, seqüenciem una població de molècules totes iguals. Amb una mostra de DNA bicatenari, separem la població de la fracció que ens interessa mitjançant electroforesi en gel d’agarosa. Com que el DNA és bicatenari, el desnaturalitzem i mitjançant electroforesi (en condicions desnaturalitzants, per a que no es renaturalitze) separem el DNA monocatenari. Aleshores marquem les fraccions amb fósfor 32 en els extrems 5’. La mescla la repartim en 4 tubs distints. En el primer tub aplicarem una reacció química que talle per guanines, en el segon per Adenines, en el tercer per timines i en el quart per citosines. En el segon, el tercer i el quart és convenient que també es talle per altres bases per a així poder comprobar els resultats i orientar-se. D’aquesta forma, la població de fraccions de DNA ens apareixerà subdividida en fraccions més xicotetes. El procediment està pensat per a que es trenque cada volta una molècula, és a dir, que en cada tall conservem una peça marcada i una altra sense marcar. Al tallar cada volta per un nucleòtid, obtindrem fraccions de distint pes molecular marcades radiactivament. Després separarem els fragments per tamany en una electroforesi en poliacrilamida, que té uns poros molt xicotets. Finalment fem una autorradiografia per a obtindre la foto de les bandes radioactives. Poesrem les quatre mostres una al costat de l’altra. La primera base no podrem conèixer-la per aquest mètod, perque al haver tallat l’enllaç entre el fósfor radiactiu i el nucleòtid, aquestes molècules seran massa xicotetes i s’escaparan de l’electroforesi. Per això començarem per el segon nucleòtid. D’aquesta forma, segons l’ordre d’aparició i la columna en la que apareguen, obtindrem l’ordre dels distints nucleótids que formen la cadena de DNA. Mitjançant aquesta tècnica, un expert pot ser capaç de seqüenciar de 100 a 200 nucleótids, i un no expert uns 50.

·        Procediment de seqüenciació enzimàtic. Mètode de Sanger. Les fases inicials i les fases finals del mètode de Sanger són equivalents al mètode químic. La principal diferència estriba en que l’obtenció de la molècula de DNA a seqüenciar és artificial, sintetitzada a partir d’enzims. Aquest procediment es basa en conèixer molt bé la replicació del DNA. Utilitzem quatre tubs d’enzims. Utilitzem una DNA polimerasa 1. És una DNA polimerasa modificada. A ella li hem llevat una part. Li donem a l’enzim tots els nucleótids necessaris i el molde (DNA acabat de replicar), i un enencebador o primer (ing.). Aquest enencebador haurà de ser complementari a les bases del principi de la cadena, les quals coneixem perque hem tallat amb endonucleases de restricció. La DNA polimerasa sintetitzarà de 5’ a 3’. La cadena molde anirà de 3’ a 5’. Li donem a l’enzim nucleótids desoxitrifosfat com sustrats. Donat que volem que cada cadena copiada acabe en un determinat nucleótid, introduïm un derivat didesoxi d’un dels nucleótids, per la qual cosa la síntesi acabarà per aquest nucleótid. Amb açò, el derivat didesoxi interromprà la reacció. Com que cada volta que ha de ficar un nucleótid, tindrà nucleótids canviats i nucleòtids modificats, obtindrem unes voltes cadenes més llargues i altres voltes més curtes, depenint de la probabilitat estadística de que s’incloguen nucleótids modificats. Aleshores fem la desnaturalització la electroforesi i l’autorradiografia. Per a marcar podem marcar el encebador, els nucleótids normals o inclús els nucleótids manipulats, incloent fósfor 32 radiactiu. També podem utilitzar molécules fluorescents, la qual cosa és un gran avantatge, perque treballar amb isótops és perillós i incómode. Inclús podem utilitzar un fluorescent distint per a cada encebador, amb el consiguient avantatge a l’hora d’analitzar els resultats. Actualment aquest métod és el més utilitzat.

Nivells superiors d’organització del DNA.

Característiques de l’estructura secundària del DNA.

L’estructura secundària del DNA és una estructura en doble hèlix. Està formada per dos cadenes antiparalel·les en disposició helicoidal sobre un eix comú. És una hèlix dextrògira, i les bases dels nucleòtids queden disposades en l’interior de l’eix (apolars), de tal forma que l’esquelet de sucre-fosfat queda per fora (polars). La hèlix té un diàmetre de 20 amstrongs, de tal forma que la distància entre les bases és de 3,4 amstrongs, i hi ha 10 resídus nucleótids per volta (cada una de 34 amstrongs). Presenta un surc major i un surc menor entre els dos esquelets sucre-fosfat. Açò és degut a que les bases s’enfronten seguint un angle menor de 180 graus respecte de l’eix de l’hèlix. En el surc major les bases estàn més allunyades i per tant més expostes, mentres que en el menor estan més pròximes. Per això les proteïnes interactuen al surc major. Aquesta estructura és molt estable degut a les interaccions mitjançant ponts d’hidrògen entre les bases. Les bases s’unixen A i T mitjançant dos ponts d’hidrògen i Ci G mitjançant tres ponts d’hidrògen. Els ponts d’hidrògen són enllaços cooperatius, la qual cosa vol dir que el conjunt de tots ells fa més força que la suma algebraica de les seues forces individuals, per la qual cosa, el conjunt de ponts d’hidrògen si que es estable i fort. A més hi ha altres forces que contribueixen a estabilitzar les estructures:

§        Ponts d’hidrògen entre les bases (ja hem parlat d’ells).

§        Interaccions hidrofòbiques ente les bases (estabilitzant). Són interaccions cooperants.

§        Interaccions electrostàtiques. Estabilitzen la molècula en un entorn aquòs (polar). Entre els grups fosfat (càrrega negativa) per una banda, i l’aigua, l’ió Mg i les histones per l’altra (les histones tenen molts aminoàcids bàsics i càrregues possitives).

Estructures.

§        Forma B: Normal. És la que trobem generalment als cromosomes.

§        Forma A: És més curta que la forma B i més grossa. El surc major i el menor són molt pareguts. Hi ha estructures que adopten la forma A. Per exemple els hibrids de DNA-RNA, perque la ribosa conté un grup hidroxilo extra que impedix la forma B. Es dona per tant durant la transcripció. Les molècules de RNA tenen a voltes estructures A. No existeixen estructures de DNA de la forma A en viu. Sols es poden aconseguir al laboratori, al sotmetre al DNA a condicions hidrófobes.

§        Forma Z: Apareix en zones alternants purina-pirimidina. És levógira i més estreta que la forma B. La metilació de les bases afavoreix la formació de la forma Z. Apareix en zones transcripcionalment inactives del DNA. A partir dels canvis conformacionals, la cèl·lula regularà l’expresió dels seus gens i per això és important que estiga d’una forma o d’una altra.

Desnaturalització-Renaturalització.

Es poden perdre les estructures secundàries sense destruir la primària. El DNA es pot desnaturalitzar i renaturalitzar fàcilment. La desnaturalització es pot realitzar sotmetent la mostra de DNA a àlcali o a calor. La renaturalització es realitza mitjançant el “templat del DNA”, baixant la temperatura lentament i esperant un temps determinat. La desnaturalització i la renaturalització tenen moltes aplicacions pràctiques. Es pot estudiar la renaturalització mitjançant l’efecte hipercròmic.

§        Efecte hipercròmic.

S’irradia a diferents llongituds d’ona la mostra que s’està renaturalitzant, i s’obté una gràfica, en la qual el màxim per als aa nn s’obté a 260 nm. Aquesta amplitud d’ona serà la qual utilitzem per a mesurar els aa nn, donat que és una característica pròpia dels aa nn. Quan desnaturalitzem i fem el mateix, podem observar com en el mateix punt, a 260 nm. hi ha un augment de l’absorvància. Aquest és l’efecte hipercròmic. L’efecte hipercròmic serveix per a seguir al procés de desnaturalització. L’augment d’absorció es deua a l’exposició de les bases quan està el DNA desnaturalitzat. Les bases presenten aromaticitat i augmenten l’absorvància de la mostra, mentres que quan el DNA està sense desnaturalitzar, les bases estan protegides per l’esquelet de sucre-fosfat. A partir de les gràfiques podem obtenir la Tm (temperatura de fusió). Les curves són típiques de cooperativitat. La Tm és proporcional al contingut de guanina+citosina. Tm és igual a la meitat de la desnaturalització total.

Tipus i funcions del ARN.

§        rRNA: RNA ribosòmic. La majoria del RNA és ribosòmic. El RNA 16s es localitza l’inici de la traducció. Són elements actius en la traducció de les proteïnes.

§        tRNA: RNA de transferència. Transporten els aminoàcids fins el ribosoma.

§        mRNA: RNA missatger. Composen el 2 o 3% del total del RNA de la cèl·lula. Transporten la seqüència genètica de nucleòtids que codifica cada proteïna.

§        HnRNA: RNA heterogèni nuclear. És específic dels eucariotes. És el precursor del mRNA

§        SnRNA: RNA petit nuclear. Participen en la maduració del hnRNA. Es troben al nucli. Específic d’eucariotes.

§        ScRNA: RNA petit citoplasmàtic. Formen orgànuls amb les proteïnes i les dirigeixen cap als seus destins. Específic d’eucariotes.

§        RNA viral: Són RNAs amb informació genètica.

Cada tipus de RNA té la seua pròpia estructura tridimensional. Són com les proteïnes, ja que aquesta estructura tridimensional particular els fa estar especialitzats en una funció éspecífica. Són sempre monocatenaris. Els més xicotets són els mRNAs.

Nivells superiors d’organització del DNA.

Els nivells d’organització serveixen per a compactar les molècules de DNA i per a regular l’expresió genètica. Els nivells d’organització són distints en procariotes i eucariotes.

§        Procariotes. Els procariotes tenen DNA circular. Aleshores es produeix un superenrollament d’aquest DNA circular. Les molècules de DNA que es diferèncien per el grau de superenrollament s’anomenen topoisómers. La forma relaxada del DNA és la que no està superenrollada.

Superenrollament possitiu. Es dona quan fem girar el DNA de forma que fem donar més voltes per base que en el model de doble hèlix de Watson i Crick. No existeix en viu.

Superenrollament negatiu. Aquest si que existeix en viu. Es dona quan girem la cadena de DNA de forma que hi hajen més bases per volta. No és una forma relaxada. El pas de la forma relaxada a la forma superenrollada negativament està controlat per les topoisomerases. Hi ha dos tipus de topoisomerases. Les topoisomerases tipus I, les quals passen de la forma tensa a la forma relaxada i no necessiten energia, i les topoisomerases de tipus II, les quals necessiten energia, ja que fan passar de la forma relaxada a la forma tensa (DNA-girases). En procariotes hi ha un equilibri entre les topoisomerases de tipus I i II, la qual cosa determina un cert grau de superenrollament. Hi ha certs antibiótics que actuen sobre les topoisomerases bloquejant-les, de tal forma que faciliten la no replicació de les bactéries.

§        Eucariotes. Els eucariotes tenen una major quantitat de DNA que els procariotes, per la qual cosa necessiten un sistema més complexe. El primer nivell de compactació és la formació dels nucleosomes. Els nucleosomes són agregats de proteïnes i histones. Les histones són 5 proteïnes i tenen pocs aminoàcids. Tenen càrrega possitiva perque són bàsiques, amb la qual cosa interactuen molt bé amb l’esquelet sucre-fosfat del DNA. El nucli del nucleosoma està format per un octàmer d’histones en torn al qual s’enrolla el DNA. L’octàmer està format per quatre histones que es repetixen dos voltes: H2A, H2B, H3 i H4. Les histones estan molt ben conservades evolutivament (apareixen molt paregudes en tots els éssers vius) degut a la seua eficàcia. La histona H1 es troba en el lloc on ixen els dos extrems de l’hebra de DNA, de tal forma que els fixa en l’octàmer. A més, l’histona H1 proporciona la base per a formar el solenoide. Després hi ha molts més nivells d’organització però no són ben coneguts. Finalment es forma el cromosoma. La reducció del tamany és de 7000 voltes i el grau de compactació és de 105 ordens de magnitud.

La replicació del DNA:

La replicació és el procés mitjançant el qual a partir d’una molècula de DNA obtenim dues molècules.

Característiques:

·        És un procès semiconservatiu, ja que sempre tindrem una hebra parental i una hebra filla en cada còpia de DNA.

·        Origen: En procariotes s’inícia sols en un punt de tota la cadena: el gen ori C. En eucariotes la replicació s’inícia en múltiples orígens (de 1000 a 10000).

·        És un procés lligat al cicle cel·lular. Es produeix en la fase S de la cèl·lula i deu anar seguida del repartiment del contingut cel·lular. Si no ocorreix açò pot significar que estem davant d’un procés tumoral.

·        És bidireccional, des del punt de vista macroscòpic, és a dir, que des del bucle de replicació, s’esten cap als dos costats.

·        És unidireccional, des del punt de vista bioquímic, ja que els enzims de replicació sols avancen en la direcció 5’ a 3’.

·        És un procés complet, de tal forma que quan comença s’ha de replicar tot el genoma de la cèl·lula.

·        És un procés complexe, tant mecànicament, ja que es dona en un espai molt reduït i a alta velocitat, però guardant molta fidelitat, com per el gran nombre de proteïnes que es veuen implicades.

·        Despesa energètica molt gran. Per a clavar cada nucleòtid consumirem dos enllaços rics en energia. Els enzims de la maquinària de replicació també consumixen energia.

Característiques generals de les DNA-polimerases.

Hi ha moltes DNA polimerases. Moltes no les coneixem. Necessiten una sèrie de requeriments per a iniciar la replicació: una seqüència molde (seqüència a copiar); necessiten un encebador amb l’extrem 3’OH lliure; necessiten desoxirribonucleótids trifosfat. La reacció requerix de l’ió magnesi perque els nucleòtids tenen càrrega negativa i es necessiten contraions.

L’enzim té activitat exonucleàsica 3’-5’, la qual cosa li conferix la capacitat de tornar arrere i corregir els errors que puguen haver sigut comesos (fidelitat). La correcció dels errors es realitza al mateix temps que la polimerització.

Els nucleótids aniran sent incorporats al trencar els dos enllaços fosfat. L’energia obtinguda serà utilitzada per a continuar la reacció.

L’enzim DNA polimerasa I també té activitat exonucleàsica 5’-3’, per la qual cosa és capaç d’anar eliminant els encebadors de l’hebra retardada.

DNA-polimerases en procariotes.

§        DNA polimerasa I: Reparació del DNA (principal) i replicació.

§        DNA polimerasa II: Sistemes de reparació (es creu).

§        DNA polimerasa III: Síntesis. És un enzim molt complicat, degut a que es tracta d’un holoenzim. És un dímer asimètric de 800 kilodaltons (molt gran). En realitat es tracta de dos agregats formats cada un per moltes subunitats. Parts:

o       Partícula central: Dímer de 3 subunitats (alpha, epsilon i   ).

o       Resta de subunitats (al menys 7) Punt d’anclatge de l’enzim al DNA. Impedixen que la DNA polimerasa III s’asolte del DNA mentres es realitza la replicació (procesivitat; impedir errors). La direcció d’avanç és de 5’ a 3’. Treballa a 1000 nucleótids per segon. La tasa d’errada és de deu elevat a menys vuit o de deu elevat a menys nou. La direcció de correcció és de 3’ a 5’.

Altres proteïnes que participen en procariotes (E.Colli).

·        DNA polimerases (I i III).

·        Proteïnes per a localitzar l’origen de replicació (DNA A).

·        Helicases (DNA B, DNA C, proteïna Rep).

·        Proteïnes estabilitzadores del DNA monocatenari (SSB).

·        Primasa (RNA polimerasa-DNA dependent, fabricant del encebador).(DNA G).

·        Ligases, per a unir els fragments de l’hebra retardada. (DNA ligases).

·        Topoisomerases, per a llevar els superenrollaments (DNA girases).

·        Proteïnes per a determinar el final de la replicació (TUS). Detecten els gens Ter. de terminació.

Replicació en procariotes.

La replicació comença en el gen ori C. Per a que comence la replicació, el gen ha d’estar no metilat i ha d’estar superenrollat negativament. Aleshores, al ori-C s’unix la proteïna d’inici de replicació (DNAa, un tetramer que s’unix per llocs determinats). En aquest moment començaran a unir-se més DNAas per cooperativisme fins formar un agregat que crea una tensió en al cadena que fa que s’obriga la doble hèlix en un punt clau del ori-C. La zona per on s’obri serà rica en adenina-timina, que tenen sols dos ponts d’hidrògen (més débils). A partir d’ací comença a realitzar-se la replicació, per a la qual cosa s’ha de muntar la maquinària de replicació. Entraran les helicases, que comencen a fer gran el forat (DNA B i DNA C). També entren en acció les proteïnes SSB, que estabilitzaran les hebres monocatenaries. Es muntarà una maquinària de replicació a cada costat de la bambolla de replicació. Quan comença a avançar l’helicasa cap als dos costats, en un d’ells anirà desapareguen el DNA A. També s’incorporaran girases que eliminaran els superenrollaments. Seguidament, s’introdueix la primasa que sintetitzarà el encebador (als dos costats de la bambolla de replicació). En aquest moment ja estarà tot preparat per a que actue la DNA polimerasa III, que anirà sintetitzant el DNA i allargant la cadena. La DNA polimerasa III estava constituïda per 2 agregats. Un funcionarà en la hebra conductora i l’altre en la hebra retardada. La hebra conductora és aquella que no presenta cap problema de replicació. La hebra retardada tindrà problemes perque el sentit de la replicació (5’ a 3’) és contrari al del moviment. La síntesi es farà a troços, utilitzant cada volta un nou encebador. Cada fragment serà un fragment d’Okazaki. La DNA polimerasa III no solta el DNA en cap moment, és a dir, que no va donant bots per a sintetitzar fragments. Açò s’aconseguix perque el DNA parental de l’hebra retardada, passa de llarg de la DNA polimerasa III, i deixa que la primasa pose encebadors cada cert període de bases, i estabilitzant la cadena amb proteïnes SSB. Aleshores l’hebra farà un bucle i tornarà a passar per la DNA polimerasa, ara en la direcció correcta, i amb els encebadors posats. Aleshores es sintetitzaran els fragments d’Okazaki. D’aquesta manera, serà l’hebra de DNA la que vaja botant quan un fragment d’Okazaki siga completat. Finalment, la DNA polimerasa I, anirà botant de encebador en encebador, llevant-los amb la seua activitat exonucleàsica 5’-3’. Aquest mateix enzim, però mitjançant la seua activitat polimeràsica 5’-3’, sintetitzarà els forats del encebador, utilitzant ella com a encebador el fragment d’Okazaki anterior, que tindrà un extrem 3’OH. La ligasa formarà el últim enllaç fosfodiester entre el final de la cadena sintetitzada per la DNA polimerasa I i el següent fragment d’Okazaki. Finalment la terminació serà un procés actiu, ja que unes proteïnes especialitzades detectaran el final de replicació i pararan l’acció de l’helicasa.

Replicació en eucariotes.

Hi ha diverses diferències importants entre la replicació en eucariotes i en procariotes. En primer lloc, la replicació en eucariotes es dona lloc des de múltiples origens. La velocitat d’avanç de la DNA polimerasa en els eucariotes és menor (50 nucleòtids per segon). Els fragments d’Okazaki sóm molt més curts (de 100 a 200 nucleótids, es creu que està relacionat amb la llongitud dels nucleosomes que és de 200 nucleótids), mentres que en procariotes són de 1000 nucleótids.

Els eucariotes utilitzen distintes DNA polimerases:

·        DNA polimerasa alpha. Replicació de l’hebra retardada.

·        DNA polimerasa beta. Reparació del DNA.

·        DNA polimerasa gamma. Replicació del DNA mitocondrial.

·        DNA polimerasa delta. Replicació de l’hebra contínua. Complexe PLNA (Antígen nuclear de les cèl·lules en proliferació). Aquest actua de la mateixa forma que la subunitat A de la DNA polimerasa III dels procariotes.

·        DNA polimerasa epsilon. Replicació i reparació del DNA. Elimina els encebadors de RNA i plena els llocs amb DNA (fa el paper de la DNA polimerasa I).

Telomerases:

Les molècules de DNA dels eucariotes no són cícliques, per la qual cosa presenten extrems. Donat que és necessari començar la síntesi de DNA amb un encebador, quan posem un encebador sobre una cadena parental i comencem la síntesi d’una cadena filla, no podrem plenar els forats que deixarà el RNA del encebador, i ens arriscarem a perdre informació genètica. En les successives mitosis que necessita un organisme, els cromosomes anirien acurtant-se i perdent informació. Per a evitar aquest defecte tècnic, apareixen els telomers, unes seqüències de DNA egoista que no contenen informació genètica, i les telomerases, uns enzims del tipus transcriptasa reversa que estan formats per una seqüència de RNA complementària al DNA egoista. La seqüència de DNA egoista es repetix moltíssimes voltes en els telòmers.

Les telomerases funcionen sintetitzant la seqüència complementària al seu RNA moltíssimes voltes en l’extrem del DNA, de tal forma que l’última seqüència és complementada amb un encebador a l’hora d’iniciar la replicació, i no importa que es perda, perque les telomerases no contenent informació genètica. El treball de la telomerasa és allargar el DNA amb aquestes seqüències inútils.

L’activitat telomeràsica d’una cèl·lula es relaciona amb la capacitat de dividir-se de les cèl·lules, de tal forma que en una cèl·lula de persona adulta, els telómers són més curts que en una de persona jove. Estan relacionades, per tant, amb l’envelliment. Però també estan relacionats amb els tumors, els quals expressen l’activitat telomeràsica de forma exagerada, i per això es divideixen indefinidament (del contrari les cèl·lules no podrien dividir-se indefinidament perque destruïrien el seu genoma.

Sempre trobarem una hebra més llarga que l’altra dins d’una doble hèlix. Els extrems de DNA no tenen estructura de doble hèlix, si no que presenten estructures més complexes.

Tècnica de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR).

Aquesta tècnica permet obtindre totes les molècules que vullguem a partir d’una sola molècula de DNA. Per tant, és una tècnica d’amplificació.

El procediment és:

·        Desnaturalitzar calentant 15 segons per a separar les cadenes.

·        Hibridació dels encebadors, és a dir, unió dels encebadors i el DNA (55 graus, 1 minut).

·        Polimeritzar (fabricar DNA) baix temperatures de 72 graus, durant mitja hora. Donat que realitzem la tècnica baix temperatures molt altes, utilitzem una polimerasa d’un organisme termòfil, la TAC-polimerasa.

·        Repetint el procés moltes voltes obtindrem 2 elevat a n-1 voltes el DNA inicial. El encebador que utilitzarem serà de DNA, per la qual cosa no necessitarem llevar-lo ni tindrem problemes de pèrdua d’informació genètica.

El diagnòstic actual està basat en la PCR. Aquesta técnica servirà per ampliar una mostra de DNA, per exemple, d’un tumor que estiga sols en 1 cèl·lula, de forma que al amplificar el DNA puguem veure’l. El major perill per a la realització d’aquesta prova és la contaminació de la mostra amb el propi DNA de l’experimentador, per la qual cosa es posen grans guants.

La transcripció:

Característiques generals.

És el procés de síntesi de RNA a partir de DNA. És un procés totalment conservatiu, la qual cosa vol dir que el DNA que utilitzem queda totalment intacte, i no podria ser d’altra forma, perque si no la cèl·lula perdria la seua informació genètica.

És un procés selectiu. No transcribim tot el DNA, com en la replicació, si no que el seleccionem abans. Seleccionarem el gen a transcriure i la cadena de DNA amb informació d’aquest gen.

La transcripció és independent del cicle cel·lular, és a dir, que no depén de que la cèl·lula atravesse una fase de mitosis o que estiga en interfase.

És un procés que està estrictament regulat, donat que és el punt principal d’expressió de la informació genètica.

La transcripció és unidireccional, tant des del punt de vista macroscòpic com microscòpic. Es realitza de 5’ a 3’ i sols en una hebra.

És un procés sense possibilitat de correcció d’errors, per la qual cosa treballa molt més lentament que la replicació, a 50 nucleótids per segon. El fet de que siga un procés tan lent, també ve condicionat perque la RNA polimerasa no necessita d’altres enzims per a realitzar la transcripció, si no que s’ho fa tot ella. La tasa d’errors és de 10 elevat a menys 5 o menys 6.

Característiques de les RNA-polimerases.

Les RNA polimerases són capaces de sintetitzar RNA a partir d’un motlle de DNA. Però la còpia no serà exacta, donat que es sustituiran les timines del DNA per uracilos, és a dir, que l’uracilo interactuarà amb les adenines. Aquestes polimerases no necessiten cebador.

Fabricaran RNA en direcció 5’ a 3’. Per a la polimerització necessitarem la cadena de DNA, nucleòtids trifosfat, i la presència de l’ió magnesi. El nucleòtid trifosfat perdrà dos dels tres fosfats. Els dos fosfats restants també es separaran, i l’energia obtinguda de la rotura dels enllaços per a donar dos fosfats inorgànics s’utilitzarà per a continuar la reacció. La rotura de l’enllaç entre els fosfats es realitzarà igual que al DNA, es a dir, mitjançant un atac nucleofílic sobre el fosfat alpha intern.

Aquest procés no és capaç de tornar arrere, per la qual cosa no hi ha capacitat d’autocorrecció (la RNA polimerasa no té capacitat exonucleàsica).

·        Procariotes: Tindran sols una RNA polimerasa que sintetitzarà tots els tipus de RNA. Té un tamany de 450 kilodaltons (la meitat que la DNA polimerasa). És un complexe complet. No necessita altres enzims. L’holoenzim estarà format per un nucli composat per quatre subunitats (dos unitats alpha, beta i beta’). Necessitarà de la presència d’una subunitat sigma que li done la capacitat de reconèixer on comença la transcripció. La RNA polimerasa sense subunitat sigma, comença la síntesi per qualsevol part. Hi haurà distintes subunitats sigma. Segons quina subunitat s’unisca, començarà la transcripció per un lloc o altre.

·        Eucariotes. Tindran varies RNA polimerases especialitzades en tres tipus de gens.

o      RNA polimerases I: Estan especialitzades en el RNA ribosòmic. Sintetitzarà tres subunitats grans dels ribosomes (de les quatre que té).

o      RNA polimerasa II: Especialitzada en la síntesi de mRNA. Realment sintetitzarà hnRNA, prexursors del mRNA, que hauran de patir una maduració.

o      RNA polimerasa III: Especialitzada en la síntesi de tRNA i de la subunitat xicoteta dels ribosomes (rRNA 5s).

Inici de transcripció.

Primer es selecciona el gen a transcriure. S’ha de localitzar reconeixent els promotors o seqüències promotores del gen. Per tal de saber què és un promotor, haurem de saber també què és una seqüència consens. Una seqüència consens és una seqüència que s’extrapola de la freqüència d’aparició d’una determinada seqüència de bases en el DNA. Les seqüències reals poden diferir en algunes bases de les seqüències consens, però quant més es pareguen a la seqüència consens, més fort serà el promotor.

·        Procariotes: En la zona –10 (deu nucleòtids abans del gen que s’ha de transcriure, i en la –35, hi ha dos seqüències consens que formen part del promotor, i formen la part clau d’aquest. Un promotor sol servir per a varios gens.

·        Eucariotes: Les seqüències consens són més grans i estan a –25 (seqüència TATA) i a –75 (seqüència CAAT) nucleòtids de l’inici del gen. Són més complexes. Poden haver-hi inclús dins del propi gen, o en altres gens molt allunyats (1000 nucleòtids abans del gen). Cada gen pot tindre varios promotors.

Elongació en procariotes:

La RNA polimerasa reconeix el promotor una volta està unida a la subunitat sigma. Aleshores es produeix el pas de promotor tancat a promotor obert. La RNA polimerasa anirà afegint el RNA a una de les dos cadenes sense la necessitat d’encebador. Per a que es produisca la transcripció, és necessària la pèrdua de la subunitat sigma. La RNA polimerasa es quedarà fortament pegada al DNA.

Realment la transcripció no necessita encebador, però, al iniciar-se sense ell és molt inestable, i la reacció no s’enfortirà fins que hi haja una seqüència sintetitzada. Si no s’arriba a una situació d’estabilitat, es pot produïr una transcripció abortiva.

En la bambolla de transcripció tindrem dos voltes i mitja de DNA superenrollat negativament, i amb les dues hebres separades. La bambolla de transcripció anirà desplaçant-se al llarg del gen conforme avance la transcripció.

Finalització en procariotes.

En els procariotes si que coneixem que la terminació de la transcripció és un procés actiu, i coneixem el extrem 3’ (en eucariotes no). Hi ha divesos tipus:

·        Independent de proteïnes: Està format per seqüències riques en guanina-citosita (unions de 3 ponts d’hidrógen, més fortes). Aquestes seqüències provoquen una resistència a l’avanç de la RNA polimerasa (disminueix la velocitat). A més, són seqüències palindròmiques, de forma que al obrir la cadena i sintetitzar RNA, aquest encaixarà amb ell mateix i formarà un bucle que encaixa en la RNA polimerasa i impedix l’avanç d’aquesta, actuant com un ganxo. La última senyal és la d’aparició de la seqüència d’adenines-timines. La unió ací serà molt més dèbil, la qual és traduïda en una seqüència d’uracilos o adenines.

·        Depenent de proteïnes: La proteïna senyal de final de transcripció més coneguda és la proteina rhó. Aquesta proteïna és un hexàmer, i pot unir-se a una seqüència determinada de RNA i pujar per ella mitjançant la despesa d’ATP, de forma que arribe a la RNA polimerasa i no la deixe treballar bé, debilitant la seua unió amb el DNA i aturant la transcripció.  Però per a frenar a la RNA polimerasa és necessària la proteïna NusA. Aquesta ocuparà la posició de la subunitat sigma, i donarà a la RNA polimerasa la capacitat de reconèixer seqüències de pausa per a detindre el procés.

Encara que hi haja una senyal de terminació, això no vol dir que sempre s’ature la transcripció en ella. Tot dependrà de les condicions del medi. Quan un virus infecta a una bactèria, pot segregar proteïnes antiterminació, de forma que la bactèria sintetitzarà els elements que li interessen al virus.

Atenuació. La transmissió i la traducció estan acoplades. En el cas en que hi hajen pocs ribosomes llegint el RNA, no obligaran a la RNA polimerasa a avançar ràpid. En el cas de que si hi hajen, aleshores la RNA polimerasa tindrà que anar més ràpid.

Transcripció en eucariotes.

És un procés molt complexe del que es coneix molt poc. Com sabem, existeixen tres tipus de RNA polimerases, especialitzades en sintetitzar distints tipus de RNA. Per a variar la tasa de transcripció del gen, s’integren moltíssimes senyals distintes.

Síntesi de mRNA (RNA polimerasa II).

En primer lloc es requerixen els factors basals o factors de transcripció. Són proteïnes que s’associen al DNA (per exemple, la proteïna d’unió a TATA). Tots els factors basals interaccionen directament amb les seqüències del promotor i amb la RNA polimerasa. Els factors de transcripció interaccionen també amb els coactivadors, que són unes proteïnes que integraran la informació que vinga dels activadors. Els activadors seran molècules que interaccionen amb seqüències del DNA anomenades intensificadors. Els activadors interaccionaran amb els intensificadors i enviaran una senyal als coactivadors. Tot aquest mecanisme potenciarà la transcripció. Però els coactivadors també poden rebre senyals d’altres molècules anomenades represors, que interactuaran amb seqüències silenciadores del DNA i que reduïran la traducció. La funció dels coactivadors és integrar tota la informació provinent de les múltiples senyals, i transmetre-la als factors basals, els quals transmetran al mateix temps a la RNA polimerasa, allò que ha de fer, amb quina freqüència de traducció i amb quina velocitat. La transcripció, per tant, no és un procés tot o res.

En els processos tumorals, moltes voltes, els oncógens són proteïnes d’activació dels factors basals (que són iguals per a totes les RNA polimerases). Per tant, algunes proteïnes que no s’han de polimeritzar, es polimeritzen, o es polimeritzen més ràpid del que haurien de polimeritzar-se.

Biosíntesi del RNA: modificacions, procesament i control.

Hi ha diferents tipus de modificacions postraduccionals del RNA possibles. Aquestes modificacions estan dirigides a donar funcionalitat al RNA. Poden acurtar les seqüències eliminant parts que no s’utilitzen, poden afegir seqüències noves o poden modificar les bases i els sucres, metilant o acetilant (tRNA i rRNA). Aquestes modificacions són molt més freqüents en eucariotes que en procariotes, degut a que la transcripció i la maduració es donen independentment de la traducció dins del nucli, ja que l’acoblament no és tan directe com en procariotes.

De hnRNA  (transcrit primari) a mRNA:

Aquestes transformacions tenen lloc en el nucli.

·        En l’extrem 5’ del hnRNA s’afegix una vaina anomenada CAP. És una estructura que serveix per a protegir al RNA de les exonucleases i per a identificar a la molècula com a missatger. El CAP serà identificat per el ribosoma. La estructura del CAP és una resta de GTP que s’afegix de forma especial, mitjançant un enllaç 5’ i tres grups fosfat. Depenint del tipus de CAP, poden apareixer bases metilades.

·        Modificació en 3’. Ací s’afegix la cua poliA. És un conjunt de nucleòtids d’adenina. Per a que s’afegisca la cua, és necessari que aparega la seqüència consens AAUAAA, que serà reconeguda per una endonucleasa que tallarà el RNA un poc després. Aleshores, arriba la poliA polimerasa, i afegix el poliA. Es suposa que la funció del poliA és de protecció, però encara no es coneix bé. Es sap que la cua poliA va acurtant-se amb el temps, però, no queda clara la seua funció perque hi ha missatgers sense cua poliA. Té molta utilitat en el laboratori, perque ens pot ajudar a separar els mRNAs de la resta de sustàncies. Si fem passar les sustàncies per un tub cromatogràfic, al que hi hajen cues poliT, interaccionaran amb les poliA i les retindran.

·        Procés de tall i empalme (Llevar els introns). Els introns es lleven simultàniament a la transcripció. Els introns i els exons es transcriuen completament. La eliminació dels introns es coneix amb el nom de splicing. S’ha de fer amb una precissió total, per la qual cosa es realitzarà per dos enllaços éster concrets. Es un procés de canvi de uns enllaços éster per altres (transesterificació). Qui indueix el procés és el propi intró (ribozim, RNA autocatalític). L’intró tindrà la informació de la seua propia exclusió. En els límits intró-exó hi ha una seqüència consens (5’GU i 3’AG). També hi haurà una seqüència rica en pirimidines de 50 a 60 nucleótids, desplaçada cap a l’extrem 3’. És molt important el centre de ramificació. És un nucleótid d’adenina que desencadenarà tot el procés, ja que es troba en un lloc estratégic. En primer lloc, el grup hidroxil en la posició 2’ del centre de ramificació atacarà a l’enllaç éster que unirà al primer exó amb l’intróen l’extrem 5’. Es lliberarà un extrem 3’OH de l’exó i es formarà un anell en l’intró. En segon lloc es produeix un atac del 3’OH del primer exó a l’enllaç entre l’intró amb el segon exó (en 5’ del segon exó), i es llibera l’intró quedant units els dos introns. Per a que tinga lloc el procés, el RNA s’ha de disposar en una conformació tridimensional determinada. Açò s’aconsegueix gràcies a l’existència d’unes ribonucleoproteines anomenades snRNP, que estan formades per snRNA i proteines. Aquests snRNPs s’associen amb el hnRNA amb CAP i formen els espliceosomes, que adquireixen la forma tridimensional adequada per a desenvolupar tot el procés de tall i empalme. Hi ha un segon sistema de tall i empalme anomenat de tall i empalme alternatiu. Consisteix en una reorganització diferencial dels exons. Es seleccionen els exons i s’ordenen, de forma que es poden obtindre varies proteïnes d’un mateix transcrit primari. És una situació molt habitual. Moltes enfermetats són causades per canvis en les bases dels introns que participen en els processos de tall i empalme.

·        Editat: És el canvi de nucleótids o l’afegiment de nous nucleótids. El procés d’editat és molt més freqüent en els eucariotes inferiors que en els eucariotes superiors.

Modificacions del rRNA i el tRNA.

Els gens que transmiteixen el rRNA estan posats un al costat de l’altre i es transcribeixen amb un únic promotor.  Posteriorment acturaran endonucleases que tallaran per determinades seqüències per a donar lloc als RNAs independents. Després, les exonucleases puliran els extrems. Finalment actuaran els enzims que afegiran sucres i bases. En el cas de les molècules de rRNA, la maduració sols acaba quan es forma el ribosoma. Cada rRNA i tRNA tindrà les seues pròpies modificacions de bases i sucres.

RNAs artificials.

RNA antisentit: és la expressió de la hebra que no es transcriu en l’organisme. Es va disenyar per a bloquejar als missatgers de proteïnes que produeixen el tumor cancerígen. Però els RNAs es destrueixen molt pronte quan no s’expresen. Actualment s’intenta que la pròpia cèl·lula fabrique el seu RNA antisentit. També s’investiga en la fabricació de DNA antisentit que puga impedir una codificació d’eixe gen.

cDNA: És la fabricació de DNA a partir d’una molècula de mRNA mitjançant la transcriptasa reversa. Permiteix obtindre proteïnes eucariotes en organismes procariotes, ja que en ell estan totalment llevats els introns. Els cDNA seran específics de teixit, ja que cada teixit expressa uns gens, i sintetitza uns mRNAs.

La traducció:

Maquinària de la traducció.

Per tal d’iniciar la traducció, ens fan falta una sèrie d’elements:

·        Ribosomes, que els trobem freqüentment agrupats en polirribosomes.

·        Aminoàcids activats, 20 (units al tRNA), dels vint tipus.

·        TRNAs (40-60).

·        Aminoacil-tRNA-sintetases específics, que uniran a l’aminoàcid amb el tRNA. Tenen la capacitat de corregir errors.

·        mRNA.

·        Factors d’iniciació (proteïnes IF1, IF2, IF3).

·        Factors d’elongació (proteïnes EF-Tu, EF-Ts, EF-G).

·        Factors de terminació (proteïnes RF-1, RF-2, RF-3).

·        Peptidil transferasa. Formarà els enllaços peptídics entre els aminoàcids. Està situada en la subunitat gran del ribosoma.

·        Codons d’inici (AUG,GUG). Són universals.

·        Codons de terminació (UAA, UAG, UGA). Són universals.

·        Ió magnesi, ATP i GTP. Necessitarem quatre enllaços d’energia per a introduïr un aminoàcid.

Tindrem una important capacitat correctora. La lectura anirà en direcció 5’ a 3’. Açò permetrà l’acoblament de la transcripció i la traducció en procariotes. La síntesi de la proteïna començarà per un grup amino i acabarà amb un grup carboxilo.

El codi genètic.

El còdi genètic és la relació entre la seqüència de nucleótids que correspon a cada aminoàcid. Característiques:

·        Còdi de triplets o condos. Cada tres bases corresponen a un aminoàcid.

·        Les bases es lligen sense superposició dels triplets, és a dir, linealment.

·        És un codi degenerat, la qual cosa vol dir que tots els triplets codifiquen per a aminoàcids, i quasi tots codifiquen més d’un aminoàcid.

·        Hi ha codons sinònims, que codifiquen el mateix aminoàcid.

·        No és ambigu.

·        És universal, excepte algunes petites excepcions.

·        Hi ha un codó d’inici i tres de parada.

Efecte de balanceig de la tercera base: La unió entre el codó i l’anticodó en la primera i la segona base, és molt més forta que en la tercera. A aquestes es produeix un reconeixement estricte. En la tercera posició el reconeixement no ho és tant. Per això molts triplets poden canviar la seua tercera base i continuar codificant el mateix aminoàcid. Les mutacions en la tercera base de cada codó tenen menys repercusió en la codificació.

Una altra forma d’expresió del codi genètic es dona en un procés anterior. L’aminoacil-tRNA-sintetasa, codifica quan unix cada aminoàcid amb el seu corresponen tRNA. Aquest no és el codi genètic estandar però està relacionat i coordinat amb ell. És un segon codi genètic.

Síntesi de proteïnes.

·        Primera fase: activació: És l’unió dels aminoàcids amb els tRNA corresponents, i ve catalitzada per l’aminoacil-tRNA-sintetasa.

·        Segona fase: iniciació: Es munta la maquinària de síntesi i es col·loca el primer aminoàcid de la proteïna.

·        Tercera fase: elongació: Es col·loquen la resta d’aminoàcids de la proteïna i s’unixen mitjançant enllaços peptídics.

·        Quarta fase: terminació: Lliberació de la cadena polipeptídica i desmuntage de la maquinària de síntesi.

·        Quinta fase: maduració: Modificacions postraduccionals  de la proteïna. Fem la proteïna funcional.

Activació:

És la unió de l’aminoàcid amb el tRNA corresponent, amb consum d’ATP. Però no per la consumició d’un enllaç ric en energia s’allibera AMP i PPi (pirofosfat). Es consumixen els dos enllaços i obtenim Pi+Pi. El procés és reversible i si la unió és errònia es torna arrere. Té la capacitat de corregir errors. Es produeix un enllaç éster entre el grup OH 3’ o 2’ (generalment està oscilant entre els dos). Es cridarà aminoàcid activat perquè ha sigut format mitjançant dos enllaços d’ATP.

Iniciació:

El primer aminoàcid sintetitzat és la formil-metionina en procariotes i la metionina en eucariotes, a partir del codó AUG. Per a que un codó AUG siga considerat com a codó d’inici, en eucariotes serà necessari que siga el més próxim al CAP, i en procariotes, deurà ser precedit per una seqüència Shine-Dalgano (AGGAGGU, seqüència consens). Aquesta seqüència s’emparella amb una seqüència paral·lela del RNA ribosòmic 16s de la subunitat xicoteta en l’extrem 3’. Aquesta subunitat és la primera que s’unix i indueix a la subunitat gran. Per això els missatgers dels procariotes poden ser policistrónics (codifiquen varies proteïnes), ja que poden tenir varios origens de traducció. Quant més pareguda a la seqüència consens siga l’iniciador, més fàcil serà la mutació.

En eucariotes, la CAP és reconeguda per els ribosomes. Després aniran movent-se fins que reconeixen el primer codó AUG. Per això els missatgers dels eucariotes sols codifiquen una proteïna.

Muntatge de la maquinària:

En primer lloc es munta el complex d’iniciació 30s. Aquest està format pels factors d’iniciació, una molècula de GTP, mRNA i el tRNA associat a la metionina, tots ells associats a la subunitat 30s del ribosoma. A partir d’aquest es forma el complex d’iniciació 70s, i s’afegixen la subunitat gran del ribosoma (50s), el GTP s’allibera com GDP i s’alliberen els factors d’iniciació.

Fase d’elongació.

L’elongació es realitza en dos “llocs”del ribosoma, el lloc P (peptidil), i el lloc A (aminoacil). En realitat seran tres llocs, com veurem després.

·        Primer pas: El lloc A és ocupat per la tRNA associat al següent aminoàcid. Es consumeix un enllaç d’alta energia GTP per a donar GDP i Pi. Utilitzem el factor d’elongació EF-Tu.

·        Segon pas: Reacció catalitzada per la peptidil transferasa. Es transfireix l’aminoàcid del lloc P i s’enganxa darrere del del lloc A. Es forma un dipèptid (o polipèptid, quan la reacció estiga més avançada).

·        Tercer pas: El triplet es desplaça (translocació). Activació del factor d’elongació EF-G. Es consumeix GTP per a donar GDP+Pi. Aleshores el tRNA+dipèptid estarà situat sobre el lloc P. En realitat hi haurà un tercer lloc (E), on estarà el tRNA sense aminoàcid (lloc d’eixida).

Haurem de consumir en total 4 enllaços ric-energètics en les fases d’activació i elongació de cada aminoacid. Havíem consumit prèviament 1 GTP per a muntar la maquinària de traducció, que ens valdrà per a tota la síntesi.

Terminació:

L’elongació s’atura quan apareix un codó de terminació, ja que no hi ha cap tRNA que identifique els triplets. Aleshores s’introdueixen en el lloc A els factors de terminació RF1 o RF2 i el RF3 + GTP. El que es fique RF1 o RF2 dependrà del tipus de codó.

Aleshores la cadena polipeptídica s’allibera. Gràcies al GTP s’alliberen els components de la maquinària de traducció.

Les distintes diferències entre la síntesi de proteïnes en procariotes i en eucariotes és una de les grans dianes per als antibiótics.

Maduració: modificacions postraduccionals.

L’objectiu de les modificacions postraduccionals és donar funcionalitat a la proteïna. Cada proteïna tindrà les seues característiques. Ací hi ha una barreja de moltes d’elles.

·        Plegament: És l’adquisició per part de la proteïna de la forma tridimensional que li donarà la seua funcionalitat. La proteïna buscarà adoptar la conformació termodinàmicament més favorable. Algunes proteïnesnecessiten de l’ajuda de les xaperones per a estabilitzar la cadena d’aminoàcids fins que acabe de sintetitzar-se i estiga completa. Aleshores les xaperones es lleven, i la proteïna es plega.

·        Modificació dels extrems amino i/o carboxilo: La metionina dels eucariotes i la formil-metionina dels procariotes del carbono N-terminal, sempre s’eliminen. A més, poden ser retirats altres aminoàcids. El N-terminal i el C-terminal poden trobar-se metilats o acetilats, o modificats d’alguna forma.

·        Establiment de ponts disulfur.

·        Eliminació de seqüències de senyalització. Algunes seqüències dirigeixen les proteïnes cap al seu destí. Després, són eliminades. S’anomenen pre-proteïnes abans de llevar la senyal.

·        Eliminació de seqüències inactivadores. S’anomenen proproteïnes a aquelles proteïnes que encara tenen seqüències que els impedixen ser funcionals. Per als enzims es poden anomenar proenzims o zimógens. La insulina, p.e. acomplix aquestes dos últimes característiques.

·        Unió de grups prostétics. S’afegixen grups no protéics.

·        Unió de carbohidrats. Es dona a l’aparell de Golgi i al RER.

·        Modificació covalent dels restes laterals dels aminoàcids. En funció del tipus de modificació es complirà una funció:

o      Fosforilació d’aminoàcids. P.e. caseina.

o      Metilació (actina i miosina).

o      Carboxilació (restes de glutamat; protrombina).

o      Hidroxilació (Prolina i lisina; colàgen)

Tecnologia del DNA.

Tecnologia del DNA aplicada al diagnòstic clínic.

TIPUS D’ENFERMETATS DIAGNOSTICABLES.

·        Infeccioses. (Presència de determinades seqüències de DNA, de virus o de bactèries).

·        Processos tumorals.

·        Enfermetats congènites.

AVANTATGES:

·        El major avantatge és la gran sensibilitat, sobretot si amplifiquem les seqüències amb la PCR. La precissió és un altre gran avantatge, ja que és absoluta.

FUNDAMENT DEL DIAGNÒSTIC:

El diagnòstic es basa en la utilització de sondes específiques de seqüències identificadores dels gens causants de l’enfermetat o dels propis virus o bactèries.

PROCEDIMENT:

Realitzem un Southern blooting. Treem el DNA, el tallem amb una endonucleasa de restricció, amplifiquem la seqüència mitjançant el PCR, realitzem una electroforesi en gel d’agarosa, i finalment hibridem amb una sonda específica la seqüència obtinguda.

RFLP:

Quan la tècnica del Southern blooting és utilitzada en el diagnòstic d’enfermetats congènites, s’anomena Anàlisi dels Polimorfismes de Longitud dels Fragments de Restricció (RFLPs). Consisteix en aprofitar-se del fet de que moltes mutacions congènites destruixen o creen nous llocs de  restricció per a les endonucleases. Si es produeix una mutació d’aquest tipus dins d’un determinat gen o prop d’ell, el patró de fragmentació de restricció canviarà, i aquest nou patró pot identificar-se amb Southern Blooting i comparar-se amb un patró fisiològic. Realitzarem aleshores un Southern Blooting utilitzant una sonda que vaja dirigida contra una seqüència del gen que ens interessa. Al realitzar la electroforesi final, observarem un patró de bandes distint, que serà característic de l’enfermetat.

Els pacients poden no estar afectats, estar-ho en un gen i en altre no (heterocigòtics) o estar afectats en els dos gens (homocigòtics). Cada patró estàndar s’anomena alelo tipus. L’alelo tipus d’una enfermetat direm que segrega lligat a la enfermetat, però el patró de bandes no reflexa el gen causant de l’enfermetat, si no que apareix sempre que apareix l’enfermetat.

Per aquesta raó existeix un percentatge de predisposició davant de la preséncia d’un gen determinat.

Aplicacions de la tecnologia del DNA a la teràpia convencional.

·        Obtenció de grans quantitats de productes d’utilització terapèutica (naturals o de diseny). Els productes obtenibles són proteïnes que puguen actuar al torrent circulatori, ja que si no no la podriem fer arribar al malalt al lloc on li faça falta. La metodologia utilitzada és la clonació.

·        Fundaments i procediments de la clonació de gens.

Unirem el gen que ens interessa a un vector de clonatge (gen que es replica autónomament) i el ficarem en una cèl·lula hospedadora. Si el vector i el gen estan ben muntats, amb un promotor molt fort, aleshores la cèl·lula produïrà la proteïna.

El gen el tindrem que extraure d’una genoteca o llibreria gènica. Una genoteca és un sistema que té tot el DNA de l’organisme convenientment fragmentat i introduït en DNA. Hi ha diversos tipus de genoteques. En funció del tipus de DNA utilitzat:

·        DNA genómic, que són específiques per a cada ésser (amb elles no podem produïr proteïnes eucariotes en cèl·lules procariotes).

·        cDNA, les quals permitixen salvar la barrera eucariotes-procariotes, ja que estan fabricades a partir de mRNA, i per tant no tenen els introns del DNA eucariota. Aquestes últimes seran específiques de teixit degut a que cada teixit expresarà una part del genoma, per la qual cosa no tots tenen els mateixos mRNAs.

Les genoteques també es poden classificar per el tipus de vector utilitzat.

·        Plàsmid PBR322: (un plàsmid és un cromosoma extra que tenen les bactéries). Els plàsmids tenen un origen de replicació i punts de tall per a les endonucleases de restricció. També tenen gens de resistència a anticossos. Aquest vector serveix per a gens de menys de 10 kilobases.

·        Fagos landa: Accepten fins a 15 kilobases. S’introdueix el gen en la part central del DNA d’un fago.

·        Genoteca de cósmids. És un híbrid de plàsmid i fago landa. Pot acceptar fins a 40-45 kilobases.

·        Genoteca de Yac. Es tracta d’una genoteca dissenyada utilitzant com a vectors els cromosomes de la levadura. Aquests vectors tindran telomers, centromers i tots els components d’un cromosoma normal i corrent. Accepten de 100 a 1000 kilobases.

Per a poder utilitzar un gen el tindrem que seleccionar de la genoteca. Per a fer-ho haurem d’infectar un cultiu de Colli amb la genoteca. Cada bactèria agarrarà un plàsmid. Tindrem que seleccionar després quina bactèria fa la proteina. Per tal de sel·leccionar-la posarem les bactèries en una placa petri i desenvoluparem colonies de bactèries infectades amb el plàsmid (clons). Aleshores posarem paper de filtre sobre la placa petri de forma que les colònies es queden pegades al paper (una mostra de cada una d’elles). Aleshores desnaturalitzem el DNA i el tractem per a analitzar la seqüència. Utilitzem una sonda (Southern blooting) per tal de reconèixer quina és la colònia que majoritàriament té el gen que ens interessa, i extraem bactèries d’ella, de tal forma que repetim el procés diverses vegades fins que amplifiquem la colònia de bactèries amb el gen que ens interessa, fent clons d’aquesta colònia, i obtinguem el gen. Per a expressar el gen haurem d’introduïr el gen en altre vector (vector d’expressió), que tindrà abans del gen un promotor molt fort.

Hi haurà dos tipus generals d’obtenció de les proteïnes que necessitem:

·        Mitjançant sistemes heteròlegs, és a dir obtenint la proteïna eucariota a partir d’organismes procariotes. Haurem d’utilitzar cDNA. També necessitarem que la proteïna a sintetitzar siga una proteïna que no necessite cap modificació postraduccional.

·        Mitjançant sistemes homòlegs, és a dir, expresant les proteïnes eucariotes en cèl·lules eucariotes. Però necessitarem cèl·lules que es puguen cultivar en un tub d’assaig.: cèl·lules de cultiu d’ovari de hamster xinés.

·        Transferència gènica a cèl·lules de mamífers.

Hi ha dos tipus: la integració dins del genoma, que és permanent, i la transitòria, que perdrà el gen en el moment que les cèl·lules es dividisquen.

Els métodes que es següeixen per a l’integració gènica són els següents:

·        Químic: Utilitzant fosfat càlcic, dimetilsulfòxid i polications. Quan posem DNA exògen en contacte amb el fosfat càlcic, obliguem a les cèl·lules a que capten el DNA per endocitosis. Aleshores hem d’utilitzar solvents (dimetilsulfòxid i polications) per a disoldre la membrana de la vesícula i fer eixir a la cèl·lula al DNA. El dimetilsulfòxid forma pors a la membrana de la vesícula, mentres que els polications envolten al DNA i el fan eixir de la vesícula.

·        Físics: Mitjançant l’electroporació (fem poros a la membrana mitjançant la electricitat) i la microinjecció.

·        Facilitats: Mitjançant liposomes, que són esferes de lípids, o virus animals. Aquests últims són específics de teixits o órgans. Són els més utilitzats.

·       Transferència a cèl·lules germinals. Amb aquestes tècniques s’obtenen animals transgènics. Una técnica molt utilitzada en investigació és el knock-out. Consisteix en lloc d’introduïr un gen en destruir-lo per a estudiar els efectes produïts sobre l’animal.

Teràpia gènica:

La teràpia gènica consisteix en utilitzar un gen diréctament en un organisme per a tractar una enfermetat. No és fàcil. Es troba en estat experimental, però actualment es fan numerosos estudis.

La teràpia gènica es pot aplicar a enfermetats congènites víriques, neoplàsiques, etc. És aplicable a totes les enfermetats (menys als traumatismes).

Poden dirigir-se a cèl·lules que estiguen malaltes, per a curar la malaltia. Açò és possible segons la enfermetat.

Hi ha diversos tipus de teràpia gènica: ex vivo e in vivo.

·        Ex vivo: Treguem les cèl·lules del pacient i introduïm el gen, per a després tornar a integrar-les en l’organisme.

·        In vivo: Li introduïm diréctament el DNA, utilitzant liposomes o virus modificats.

No és necessari incorporar el gen a totes els cèl·lules malaltes, sols és utilitzable en cèl·lules somàtiques.